神经肽P物质与神经生长因子NGF在不同时期增生性瘢痕的差异

胥 广 黄 东 刘银平 张大卫 宋 溦：南华大学教学医院/广东省第二人民医院 广东广州 510317
通讯作者：黄 东

神经肽P物质与神经生长因子NGF在不同时期增生性瘢痕的差异

胥 广 黄 东 刘银平 张大卫 宋 溦
SUBSTANCE P AND NERVE GROWTH FACTOR NGF IN DIFFERENT PERIOD OF HYPERTROPHIC SCAR
XU Guang, HUANG Dong, LIU Yinping, et al

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  【摘 要】 目的 探索神经纤维（NS）、神经生长因子（NGF）及神经肽P物质（SP）在不同时间增生性瘢痕（HS）中结构、分布及含量的差异。方法 收集2013年3月~2015年1月的30名HS患者的30例样本，按照时间分成早期A组（6个月内）、中期B组（6~18个月），晚期C组（18个月以上）。分别用苏木精-伊红（HE）染色、免疫荧光、免疫组化法染色A、B、C三组HS与正常皮肤，依次观察各组HS的形态结构差异、NGF与SP在瘢痕中分布情况、神经纤维（NS）结构变化，并通过使用IPP 60软件分析比较神经纤维（NS）、NGF、SP在正常皮肤与不同时期HS中含量的差异。结果 NGF与SP的免疫组化染色中HS的真皮层分布最广泛，其次是表皮的基底层，而在真皮与皮下组织感觉神经末梢、微血管、肥大细胞、成纤维细胞、胶原纤维中含量极高。通过IPP 60测算阳性颗粒含量面密度平均值为A组SP(0089±0023)，NGF(0103±0034)，NS（3808±783）；B组SP（0132±0025），NGF（0198±0027），NS(1707±484)；C组SP（0078±0018），NGF(0078±0011)，NS(1207±568)。结论 神经类蛋白SP与NGF均广泛分布并高表达于HS各层中的组织及细胞；不同时期瘢痕中神经纤维的数目、神经类蛋白SP与NGF的含量是不同的，且神经构筑的变化及其分泌蛋白含量的变化与之不同步，推测SP与NGF在HS形成中起协同作用，在早期以神经纤维的调节为主，而中晚期以成纤维细胞调节为主。
  【关键词】 增生性瘢痕,NGF,SP,神经构筑
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.05.002

  随着人们生活水平的提高，对于审美及功能的要求也越来越高，而瘢痕严重影响患者的容貌，其挛缩又可导致不同程度的功能障碍，为该类患者带来沉重经济和心理负担［1］。近年来关于神经因素在瘢痕中所起的作用日益受到重视，感觉神经末梢作为增生性瘢痕的营养基础，它分泌的SP及NGF在微血管重构、胶原纤维的增生方面发挥了重要的促进作用［2］，但关于二者在不同时期HS的分布规律鲜有报道，机制上的认识也不完善。本文通过对HS按时间进行分组，从多个角度对瘢痕中起重要作用的神经纤维（NS）及其释放的神经生长因子（NGF）与神经肽P物质（SP）进行探索及分析，并找规律，拟阐明不同时期HS中NS的变化与NGF、SP变化的相关性，为临床诊治及进一步的科学研究提供理论依据。
     1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
     苏木精-伊红染色剂、二甲苯替代品、PBS溶液、梯度浓度的酒精、3%的BSA溶液、DAB显色剂由迈博新公司提供；免疫荧光抗体NFP、免疫组化抗体：SP、NGF由广州外显子生物科技有限公司提供；光学显微镜由尼康公司提供，普通荧光显微镜由奥林巴斯公司提供；MD 20真彩医学图像分析仪由莱卡公司提供。
1.2 增生性瘢痕的标本的收集及分组
     标本取自我院，从2013年3月～2015年1月的30名创伤瘢痕患者的30例标本，实验前经过广东省第二人民医院伦理委员会批准，所有实验标本均在取标本时告知患者相关伦理委员会要求，实验过程中严格按照《中国实验伦理标准》进行。所取30例标本均经临床医生鉴定为增生性瘢痕（HS），且所有患者既往均无慢性病史及皮肤病史，术前半年无瘢痕药物治疗史。
     根据患者病史将标本按HS形成的时间进行分组，其中6个月内实验组9例，7~18个月实验组11例，超过18个月实验组10例；以其HS样本的周围正常皮肤为对照组。
1.3 HE染色观察
     组织标本切下后4%多聚甲醛固定过夜，次日石蜡包埋作石蜡切片（5 μm厚），置于4 ℃冰箱待用。后依次经过下述步骤进行HE染色：①烤片：80 ℃烘烤3 h（防止脱片）。②脱蜡水化：二甲苯替代品脱蜡2次，每次5分钟。梯度酒精水化，酒精100％、85％、70％、50％，每次5分钟。③PBS洗涤，每次5分钟，共2次。④苏木精染色2分钟，蒸馏水冲洗。⑤伊红染色4分钟，蒸馏水冲洗。⑥晾干，中性树胶封片。于光学显微镜下观察样本中各层次的结构、神经纤维、胶原纤维、微血管、汗腺、毛囊、肥大细胞、淋巴细胞、多核白细胞的分布、数量、形态。
1.4 免疫组化染色与免疫荧光染色观察目标蛋白的分布
     将分好组的标本切片依次按照按下列步骤染色，步骤之间用PBS 冲洗（3×5分钟）。①脱蜡水化：石蜡切片于70 ℃烤箱烘烤2 h，放入二甲苯替代液（5×3分钟）脱蜡,再依次放输入梯度浓度的酒精100％、85％、70％、50％，每次5分钟；②抗原修复：甩干玻片并放入保湿盒中，滴入3％双氧水，室温孵育10 ~ 20分钟，去除内源性过氧化氢酶，蒸馏水冲洗后，放入沸腾的柠檬酸钠缓冲液微波低火15分钟，待其冷却至室温后取出切片；③封闭抗原：滴入3％BSA溶液，室温孵育20分钟，吸去多余的液体；④加一抗（SP、NGF、NFP抗体），4 ℃冰箱过夜；⑤加酶标二抗 （HRP Polymer），室温孵育20分钟；⑥显色：加新配制的DAB 液，镜下观察显色3~10分钟，双蒸水冲洗；⑦复染：苏木素复染3~8分钟后中性树胶封固。分别于光学显微镜及普通荧光显微镜下观察样本各层次中目标蛋白的分布、结构、形态。用图像分析仪在25 倍物镜下自表皮向深层方向连续观测5 个视野，由计算机图像分析软件IPP 60求出阳性NS标记物神经丝蛋白（NFP）面积比、NGF、SP 阳性颗粒分布的表面积密度，每组测定10 张切片。
1.5 统计学分析
     对于NGF、SP、NS的标记物NFP表达量的数据，应用SPSS 170软件进行数据分析，同时结果采用(±s)的方式进行描述，并采用LSD-t检验对各组进行分析比较，以p<005为差异有统计学意义。
     2 结果
2.1 增生型瘢痕的HE染色观察
     镜下HE染色正常皮肤组织结构层次清楚，表皮薄，形状多变、扭曲，厚度变化大。基底层至角质层细胞渐扁平，各层结构完整，形态正常，排列整齐，角质层薄，基底层中有数量正常的黑色素细胞分布，表皮钉脚较多且深入真皮组织中。真皮中可见与表皮交界部位的乳头层和网织层，乳头层细胞成分较多，网织层则胶原纤维较多，且胶原纤维粗细均匀，呈螺旋状，可见神经、血管、毛囊、皮脂腺、汗腺等皮肽附属器(图1A)。
     而不同时间HS组中，6个月内HS中表皮较薄，表皮整体厚度较正常的比较均一，变化不大，但表皮各层细胞从下往上细胞渐扁平，已丧失正常形态，成分欠完整，表皮钉角消失，如基底层黑色素细胞、颗粒层与棘层减少或消失，真皮中大量增粗无序的胶原纤维。7~18个月内HS中表皮增厚且明显高于正常，总体仍是从下往上细胞渐扁平，细胞成分欠完整，且丧失正常形态，真皮中乳头层乳头数量少于正常皮肤，其下可见增生的微小血管与触觉小体（感觉神经末梢结构），真皮网织层中胶原纤维粗大，排列杂乱；18个月以上实验组表皮角质层与正常皮肤相比由薄变厚，再基本恢复正常，但基底层黑色素细胞明显多于正常皮肤，其网织层的胶原纤维变细，排列杂乱，稀疏,毛囊、汗腺、皮脂腺数量较少。如图1B、1C、1D。

 A:正常皮肤组织;B:擦挫伤6个月;C:擦挫伤12个月;D:擦挫伤27个月

图1 不同时期增生性瘢痕各层次比较

2.2 NS的标记物NFP的免疫荧光结果
     荧光镜下,神经纤维发出翠绿色荧光。正常皮肤组织中呈条带状或细丝状，同一神经纤维的粗细均匀，排列和分布规则，少见粗大神经束。如图2。
     与之比较的早期HS中神经纤维粗细不均匀，形态不规则，分支较多，走行扭曲缠绕，多成团或成簇出现，呈现出较正常皮肤更为复杂的网络关系，而且其分布也不均匀，常见于胶原纤维之间，有时也在毛囊、血管周围、触觉小体、环状小体，中期HS中神经纤维较细，排列分布不规则，分支减少，相互铰链也减少，部分可见折痕和局部破损甚至崩解，局部有纵向或横向的断裂。晚期HS中神经纤维短小，粗细较均匀、近似于正常神经纤维，相互间交连少，分布规整。定量分析显示：HS早期神经纤维阳性面积明显高于正常，中期、晚期神经纤维数量阳性面积低于正常对照。差异有统计学意义（p<005），如图2B、2C、2D，表1。

 A：正常皮肤组织;B：手术伤口6个月;C：锐器伤伤12个月;D：擦挫伤27个月

图2 HS不同时期神经分布、形态、数目比较

表1 不同时间HS中神经纤维IPP 60测算结果

HS神经纤维 阳性面积比	对照组	实验组
		6个月内	6~18个月	18个月以上
平均值	27.38±9.13	38.08±7.83	17.07±4.84	12.07±5.68

2.3 SP的免疫组化的结果
     与正常皮肤比较，HS中SP大量分布在微血管周围、神经末梢、肥大细胞、多核白细胞、成纤维细胞以及皮肤附件周围。而正常皮肤中SP表达主要在肥大细胞、神经末梢、汗腺与微血管周围，于成纤维细胞的分布并不明显。中期染色程度最深，早期及晚期差异不明显，但仍明显高于正常皮肤，镜下直视观察差异性不明显；但通过图像分析仪定量分析显示：HS中早、中期SP的含量随时间延长增多，晚期会逐渐降低，但仍高于正常皮肤。正常皮肤含量(0066±0015)。差异有统计学意义（p<005）如图3、表2。

 A:正常皮肤组织与；B:增生性瘢痕
图3 SP抗体在正常皮肤组织与增生性瘢痕的表达特点

表2 形成时间不同的增生性瘢痕IPP 60测算SP结果

增生性瘢痕 形成时间	对照组	实验组
		6个月内	6~18个月	18个月以上
平均含量	0.066±0.015	0.089±0.023	0.132±0.025	0.078±0.018

2.4 NGF的免疫组化的结果
     与正常皮肤相比HS中NGF 阳性颗粒分布广、密度高、表皮基底层染色颗粒较多，但真皮乳头层与成纤维细胞聚集处着色最浓。但正常皮肤NGF 阳性颗粒少，染色淡，主要分布表皮基底层的小血管，皮肤附件周围，真皮层少见。而不同时期HS相比，中期染色程度较深，早期与晚期镜下观察差异性并不明显。但图像分析仪定量分析精确显示：NGF在HS中早、中期含量随着时间的延长而增多，但晚期会随着时间延长而降低，但仍高于正常皮肤。正常皮肤含量(0019±0003)。差异有统计学意义（p<005）。如图4、表3。

A:正常皮肤组织;B:增生性瘢痕

图4 NGF抗体在正常皮肤与增生性瘢痕的表达特点

表3 形成时间不同的增生性瘢痕IPP 60测算NGF结果

增生性 瘢痕时间	对照组	实验组
		6个月内	6~18个月	18个月以上
平均含量	0.019±0.003	0.103±0.034	0.198±0.027	0.078±0.011

3 讨论
3.1 增生性瘢痕临床评估与鉴定
     瘢痕是创伤后真皮组织的一种自然修复反应，但异常增生则导致病理性瘢痕。临床上通常将病理性瘢痕分为浅表性瘢痕、萎缩性瘢痕、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩四类，病变局限于伤区范围之内者称为增生性瘢痕(Hypertrophic Scar，HS)，占914％，为临床上最常见病理类型［3］。但HS形成时间不同，临床表现往往不同，对应治疗手段也不同,所以有必要对不同时期的HS深入研究。通过本研究收集的30例HS样本及追溯相关病史可知，临床上HS共同特征是病变范围仅局限病损区间内，但突出皮面，高低不平，形状不规则，质地较实韧。但不同时期的HS在色泽、厚度、质地、血管、感觉表现上往往不一样，中晚期色泽较深，局部色素沉着也较多，早期、中期患者潮红充血的较多，有的患者可出现灼痛和瘙痒感，环境温度增高，情绪激动，或是进食刺激性物时加剧，部分晚期患者甚至出现挛缩畸形，影响正常功能活动。但部分患者瘢痕消退，外观较正常皮肤差别不大，有文献报道HS退行性变化往往是在后续几个月或几年后才发生的［4］，我们从追溯患者病史中可发现2年后患者中，有部分患者突起的瘢痕高度减低，色转暗，充血消退，变软，部分患者HS最终平复，痛痒症状也减轻或消失。所以不同时间HS的不同患者其临床表现与转归，往往也不同，近年来研究表明这与SP跟NGF的变化规律有密切相关性［5］，但关于其机理并不清楚。
3.2 增生性瘢痕镜下结构差异
     同是HS患者，若形成时间不同，其临床表现、有效治疗手段、治疗效果存在很大差异。近年研究表明这些差异的成因与HS形成中神经纤维的结构数目以及功能变化而引起的微血管、肥大细胞、淋巴细胞、胶原纤维等结构与功能的变化密切相关［6］。本研究观察并分析不同时期HS，比较其差异性，观察到HS表现既有共性又有个性，共性是较正常皮肤而言，其表皮层中角质细胞数目减少，而真皮层钉角形态不规则，钉角数减少或消失，毛囊与汗腺减少甚至消失，胶原纤维大小不一，排列结构紊乱，无序。但总体变化趋势是表皮层随着HS形成时间延长由薄变厚，渐高于正常皮肤，然后变薄，最后与正常厚度相当，而真皮与皮下淋巴细胞、肥大细胞、成纤维细胞，多核白细胞变化变现趋势大致为由多变少，但高于正常皮肤。但不同时期HS各成分又有不同，其中最重要也是较明显的变化是神经结构变化，本研究发现早期HS中神经纤维数目与血管数目较晚期中期HS有增多，在形态上早期神经构筑已经开始改变，部分神经纤维变得粗大，不均匀，结构排列不规则，支链较多，走行扭曲缠绕，多成团或成簇出现，呈现出较正常皮肤更为复杂的网络关系，且其分布亦不均匀，出现在胶原纤维之间，有时在毛囊及血管周围也可见到神经纤维、神经束、触觉小体与环状小体。而中期神经纤维数目明显降低于正常，晚期最显著变化是神经纤维短小，粗细较均匀、近似于正常神经纤维，相互之间交连少，分布规整，数目减少，也低于正常。但导致这一状况的原因目前认识并不十分完善，近年来有学者研究表明它的出现与神经肽类物质的影响有着密切的关系。
3.3 神经肽P物质（SP）与神经生长因子（NGF）在增生性瘢痕中的意义
     SP是一种常见的神经肽。有研究表明外源性的SP可刺激HS中成纤维细胞的增殖分化，增加血管的发生、扩张和胶原过度合成,并参与组织水肿与炎性反应，还能趋化肥大细胞释放活性因子，从而导致增生性瘢痕局部瘙痒、潮红等症状，在创伤愈合及瘢痕增生中起非常重要的作用［7］。而且SP还能影响HS的神经构筑改变，有研究证实SP的低表达是胎兔皮肤无瘢痕愈合的机制之一，外源性SP可导致胎兔皮肤瘢痕愈合，能引起急性神经源性炎症反应和神经纤维的增生［8］。而增多的神经末梢数目直接导致SP的释放增多，从而引起HS中成纤维细胞更高水平的SP释放，而这很可能是早期HS组织中SP表达增高的重要原因［9］。近年来研究表明SP还可直接促进成纤维细胞增殖以及胶原纤维的合成和分泌增加，所以它也是瘢痕增生的重要分子之一［10］。本研究通过对不同时间的HS中SP的含量进行测量，发现早期HS中SP是随着HS形成时间延长而增多的，但到达一定时间后，维持在一定的较高的恒定水平，因此推测这很可能跟中晚期HS中神经数目减少，分泌SP的主要细胞变为成纤维细胞有关。
     神经生长因子NGF也是一种常见的神经肽，杨东运等［11］通过研究NGF对局部HS组织中多核白细胞、肥大细胞等炎性细胞与胶原沉积的影响，发现NGF能趋化成纤维细胞，促进单核、巨噬细胞和多形核白细胞、淋巴细胞增殖，促使肥大细胞脱颗粒现象增加，并启动病理性胶原代谢，导致胶原的过度堆积。有证据表明HS中存在神经纤维严重再生不全这一环境，在该环境下，受机体反馈调节局部的靶细胞便合成大量NGF，从而使NGF维持较高水平［12］。本实验同时也通过图像分析仪对不同时间的HS中NGF的含量进行测量，发现早期的瘢痕中NGF也是随着瘢痕形成时间延长而增多，但到达一定时间后维持在一定的较高的恒定水平，并不是随着时间延长而一直增高，这一点与SP的情况相类似。
     既往研究对SP与NGF认识多停留在广泛分布于外周及中枢神经系统的细胞信使分子上，近些年的研究表明，在HS中此类分子明显高于正常皮肤，还广泛分布于瘢痕的表皮基底层、真皮乳头层、皮下小血管等，不仅神经末梢能够释放，肥大细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞均能释放，并在HS的形成过程中发挥了重要作用［13］。而感觉神经纤维与微血管作为瘢痕的营养基础，在HS形成中发挥着重要作用，有人证实在HS神经末梢分泌的SP与NGF还能反作用于神经纤维，直接影响着血管与神经构筑，同时还能使瘢痕中最重要的成纤维细胞异常增殖及分泌胶原，形成胶原纤维［14］。本实验表明SP与NGF在HS的表达均维持在较高的水平，并随着时间的推移而增加，而到晚期时又会有所下降，直到维持较正常皮肤稍高的恒定水平，并非是一直随着时间延长而增高，并且二者的含量的变化趋势是几乎是一致的。而李昊［15］等对增生性瘢痕神经构筑实验研究证实创伤后瘢痕组织中的神经纤维的数量变化并不是简单地一直随时间变化而变化，而是达到一定时间后减少至低于正常水平，并且维持较长段时间的恒定水平，而后又升高至略高于正常水平。因此笔者推测SP与NGF在HS的形成中一直发挥着协同作用，早期主要是受神经纤维调节，中晚期受神经调节的方式下降，而成纤维细胞的调节逐渐成主流。
     总结，通过本实验研究可以清楚地认识到不同时期的HS各层次特点，NS、SP、NGF分布、形态结构与含量的变化趋势。当然，仅凭这点并不能充分说明它们在HS 形成中发挥了重要的促进作用，我们另有实验证实，NGF与SP在HS形成过程中通过NF-KB通路发挥了协同作用，并能够促进成纤维细胞的过度增殖、病理性胶原的过度代谢，从而为肉毒素能有效治疗早期HS提供了更详实的分子生物学的理论依据（待发表），这也是后续实验中重要实验依据与基础。

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