毛细管电泳在产前诊断地中海贫血中的应用

基金项目：广东省医学科研基金(编号:B2014024） 
郭 浩 郭 莉 唐 斌 陈汉彪 杜 丽 王奕霞：广东省妇幼保健院 广东广州 511400

毛细管电泳在产前诊断地中海贫血中的应用


郭 浩 郭 莉 唐 斌 陈汉彪 杜 丽 王奕霞
DIAGNOSTIC UTILITY OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS IN PRENATAL DIAGNOSIS SCREENING FOR THALASSEMIA
GUO Hao, GUO Li, TANG Bin, et al 

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  【摘 要】 目的 探讨毛细管电泳技术在产前诊断地中海贫血中的应用价值。方法 2013年1月~2014年6月期间在本院因夫妇双方为同型地中海贫血为产前诊断指征且孕周为24~34周的就诊病例286例。对脐带穿刺后获取的脐血标本进行血红蛋白毛细管电泳和地中海贫血基因诊断。结果  286例标本中，正常83例，巴氏水肿胎21例， Hb H 13例，轻型α-地贫86例，静止型α-地贫11例，重型β-地贫15例，轻型β-地贫51例，α复合β-地贫6例。脐血血红蛋白组成分析显示α-地贫胎儿脐血Hb Bart’s百分含量随受累α-珠蛋白基因个数的增加而增多，β-地贫胎儿脐血Hb A百分含量随受累β-珠蛋白基因个数的增加而减少。结论 毛细管电泳能辅助诊断孕晚期胎儿α地中海贫血及β地中海贫血。
  【关键词】 地地中海贫血,脐血,毛细管电泳 
  【Abstract】 Objective To study the diagnostic utility of capillary electrophoresis in prenatal diagnosis screening for thalassemia. Methods Between January 2013 and June 2014, 286 pregnant women were recruited who attended the prenatal diagnosis screening for thalassemia with hemoglobin electrophoresis and genetic testing at third term．Results With the genetic testing, 83 cases were normal; 21 cases were homozygous α-thalassemia; 13 cases were α-thalassemia intermedia; 86 cases were mild α-thalassemia; 11 cases were 'silent' α-thalassemia. Besides, 15 cases were homozygous β-thalassemia; 51 cases were heterozygotes β-thalassemia; 6 cases were compound heterozygotes mutation of the α and β-globin chain gene. The results showed that increased Hb Bart's level or the proportion of Hb A in fetuses could be induced by the severity of thalassemia. Conclusion Capillary electrophoresis was definitely helpful in prenatal diagnosis screening for thalassemia at the third term.
     【Key words】  Thalassemia, Cord blood, Capillary electrophoresis
     【Author′s address】 GuangDong Women and Children Hospital, Guangzhou, GuangDong,511400, China
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.06.008

  地中海贫血是由于珠蛋白链减少或缺如所造成的血红蛋白异常疾病，常见类型有α-地贫和β-地贫两种。我国南方，尤其是广东、广西、海南为高发区。重型地中海患者需要依赖长期输血维持生命，严重影响患者生活质量，也给家庭造成极大的经济负担。干预重症地贫患儿的出生是控制出生缺陷的关键。本研究收集286例在本院因夫妇双方为同型地中海贫血为产前诊断指征且孕周为24~34周的就诊病例。B超下行胎儿脐静脉穿刺术，同时对采集的脐带血进行毛细管电泳和地中海贫血基因诊断。现报道如下。
     1 资料与方法
1.1 研究对象
     收集2013年1月~2014年6月期间在本院因夫妇双方为同型地中海贫血为产前诊断指征且孕周为24~34周的就诊病例286例。
1.2 方法
1.2.1 标本采集 在B超下行胎儿脐静脉穿刺术，抽取脐静脉血1 mL于ACD抗凝管。 
1.2.2 脐血血红蛋白毛细管电泳分析 采用Sebia公司生产的Capillarys 2全自动毛细管电泳仪及其配套毛细管电泳试剂盒。按照仪器操作程序进行操作，若标本量不足2 mL可选择手工稀释程序，标本18 μL加入装有90 μL溶血素的稀释杯中混匀，置于样品架推入Capillarys 2全自动毛细管电泳仪进行检测，每架可检测8个标本。约15 min后检测程序结束，查看曲线图并分析数值。 
1.2.3 地贫基因检测 缺失型α-地中海贫血采用gap-PCR法检测--SEA、-α3.7、-α4.2三种常见缺失型。非缺失型α-地中海贫血及β-地中海贫血基因诊断采用PCR结合反向斑点杂交法检测。非缺失型α-地中海贫血检测范围为αCS、αWS、αQS三种常见点突变。β-地中海贫血基因诊断检测17种突变位点: CD41-42（-CTTT）、IVS-Ⅱ-654（C>T）、-28（A>G）、CD17（AAG>TAG）、CD71-72（+A）、 CD26（GAG>AAG）、CD27/28（+C）、-29（A>G）、CD14-15（+G）、CD43（GAG>TAG）、IVS-Ⅰ-1（G>T）、IVS-Ⅰ-5（G>C）、起始密码子突变Initiation Condon（ATG>AGG）、-30（T>C）、CD71-72（+A）、-32（C>A）、CAP+40-43（-AAAC）。试剂盒由深圳亚能生物有限公司生产。
     2 结果
2.1 地中海基因检测结果
     286例标本中，正常83例，巴氏水肿胎21例， Hb H 13例，轻型α-地贫86例，静止型α-地贫11例，重型β-地贫15例，轻型β-地贫51例，α复合β-地贫6例。 
2.2 脐血血红蛋白组成分析
     α-地贫胎儿脐血Hb Bart’s百分含量随受累α-珠蛋白基因个数的增加而增多，21例巴氏水肿胎的Hb Bart’s含量高达(82.5±4.87)%。β-地贫胎儿脐血Hb A百分含量随受累β-珠蛋白基因个数的增加而减少，15例重型β-地贫的Hb A含量只有(0.67±0.81)%，其中11例重型β-地贫的脐血血红蛋白组成分析检测不到Hb A含量。见表1。

表1 286例产前诊断脐血血红蛋白组成分析

(±s)

血红蛋白类型	Hb A(%)	Hb F(%)	HbBart's (%)	Hb H(%)	Hb Portland(%)
正常（n=83)	8.83±2.49	89.0±2.13	-	-	-
巴氏水肿胎（n=21)	-	-	82.5±4.87	2.03±0.74	6.32±3.71
Hb H（n=13)	9.61±3.44	77.5±2.83	20.1±2.31	0.93±0.62	3.18±1.92
轻型α-地贫（n=86)	9.86±2.42	84.8±2.51	5.61±1.99	-	1.16±0.63
静止型α-地贫（n=11)	9.58±3.51	87.5±4.22	0.8±0.21	-	-
重型β-地贫（n=15)	0.67±0.81	98.8±1.02	-	-	-
轻型β-地贫（n=51)	3.65±0.91	95.9±0.97	-	-	-
复合型地贫（n=6)	6.43±1.97	93.3±0.92	-	-	-

3 讨论 
     本次研究将胎儿脐血同时进行基因诊断及全自动毛细管电泳分析，通过基因诊断的基因型结果来分析全自动毛细管电泳技术的临床价值。脐血血红蛋白组成分析显示α-地贫胎儿脐血Hb Bart’s百分含量随受累α-珠蛋白基因个数的增加而增多。若胎儿为巴氏水肿胎或Hb H，由于α2和α1基因缺失或发生点突变，胎儿体内过多的γ-珠蛋白形成Hb Bart’s (γ4)，或者过多的β珠蛋白形成Hb H (β4) ［1］。本研究在巴氏水肿胎、Hb H、轻型α-地贫胎儿中还检测到Hb Portland (ζ2γ2)的存在。通常ζ-链在胚胎发育的第5~8周表达，随后就关闭。但当α-珠蛋白基因簇发生缺失时，ζ-基因表达延迟，在本该关闭的阶段仍然能检测到Hb Portland的存在［2］。
     与此同时，本研究显示β-地贫胎儿脐血Hb A百分含量随受累β-珠蛋白基因个数的增加而减少。15例重型β-地贫的Hb A含量只有(0.67±0.81)%，其中11例重型β-地贫的脐血血红蛋白组成分析检测不到Hb A含量。这是由于在胎儿发育至24周阶段时，α-链与γ-链形成Hb F（α2γ2），与β-链形成Hb A（α2β2）。按照α-和β-珠蛋白基因簇在发育时期沿着5’端至3’端的方向依次表达的规律，随着γ-珠蛋白基因的表达达到高峰，Hb F成为这个阶段胎儿的主要血红蛋白［3］。若胎儿为重型β-地贫，由于β基因发生点突变，β-珠蛋白表达缺如，无法形成Hb A。由于胎儿脐带血的血红蛋白组分和成人不一样，将胎儿脐血标本同时进行基因诊断及全自动毛细管电泳分析，还可以达到辅助鉴定母血污染，核对样品正确与否的目的［4］。
     地中海贫血是一种危害人类健康的遗传性疾病，广东为高发区之一。尹爱华等［5］调查广东省21个地区总体数目为40 808人的地中海贫血基因携带率，研究结果显示育龄夫妇地中海贫血携带率为16.83%。如果双方若同为同基因型轻型地贫基因携带者，其子代的遗传机率是1/4为正常胎儿，1/2为轻型地贫，1/4为重型地贫患者。如果双方为中、重型地贫患者，他们孕中、重型地贫胎儿的概率更高。由于目前尚无有效可靠的治疗地贫方法，防止重型地贫患儿的出生是目前唯一的有效预防措施。本研究在286例因夫妇双方为同型地中海贫血为产前诊断指征的病例中，检出巴氏水肿胎21例，Hb H 13例，重型β-地贫15例，有效地防止了重型地贫胎儿出生。
     综上所述，联合毛细管血红蛋白电泳和地中海贫血基因诊断技术可共同分析孕晚期胎儿的地贫基因，尤其是毛细管血红蛋白电泳对重型地中海贫血的判断，准确率很高，可以作为辅助产前诊断的手段之一。

参考文献
［1］ WAJCMAN H, MORADKHANI K. Abnormal haemoglobins: detection & characterization［J］. Indian J Med Res, 2011(134):538-546.
［2］ LI TK, LEUNG KY, LAM YH, et al. Haemoglobin level, proportion of haemoglobin Bart's and haemoglobin Portland in fetuses affected by homozygous α0-thalassemia from 12 to 40 weeks' gestation［J］. Prenat Diagn, 2010, 30(12-13):1126-1130.
［3］ OU Z1, LI Q, LIU W, et al. Elevated hemoglobin A2 as a marker for β-thalassemia trait in pregnant women［J］. Tohoku J Exp Med, 2011, 223(3):223-226.
［4］ LIAO C, YANG X, LI FT, et al. The detection of aneuploidy and maternal contamination by QF-PCR in samples undergoing prenatal diagnosis for thalassemia in Southern China［J］. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2009, 144(2):149-152.
［5］ YIN A, LI B, LUO M, et al. The prevalence and molecular spectrum of α- and β-globin gene mutations in 14,332 families of Guangdong Province, China［J］. PLoS One, 2014, 9(2):89855.