蛇葡萄素对大肠癌细胞株SW480增殖、凋亡的影响

基金项目：2013年广东省自筹经费类科技计划项目（编号：39）
马海芝 史振军 杨振淮：广州市中医医院 广东广州 510130

蛇葡萄素对大肠癌细胞株SW480增殖、凋亡的影响


马海芝 史振军 杨振淮
THE EFFECT OF AMPELOPSIN ON THE APOPTOSIS INDUCTION AND CELL GROWTH INHIBITION OF HUMAN COLON CANCER SW480 CELLS
MA Haizhi, SHI Zhenjun, YANG Zhenhuai

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  【摘 要】 目的 研究蛇葡萄素在体外对人大肠癌细胞株SW480增殖及凋亡的影响。方法 采用不同浓度的蛇葡萄素处理SW480细胞后，利用MTT法检测细胞活性， TUNEL法检测细胞凋亡，Western-blot检测Bcl-2蛋白水平。结果 不同浓度的蛇葡萄素均能抑制SW480的细胞的增殖，低浓度与高、中浓度组对细胞增殖抑制情况有显著性差异（p<005），而中、高浓度组间无显著性差异（p>005）。低、中、高浓度蛇葡萄素均能有效诱导SW480细胞凋亡，低浓度与高、中浓度组对细胞诱导效果有显著性差异（p<005），而中、高浓度组间无显著性差异（p>005），Western-blot显示Bcl-xL的表达显著下调（p<005）；Bax、Bid、 Caspase-3、p-Capase-9及Caspase-9的表达显著上调（p<005）。结论 蛇葡萄素能抑制结肠癌SW480细胞增殖，诱导其凋亡，其对凋亡的诱导作用主要是通过Bcl-2家族蛋白实现的。
  【关键词】 蛇葡萄素,细胞株SW480,抑制增殖,细胞凋亡

  【Abstract】 Objective To investigate the effect of ampelopsin on apoptosis induction and cell growth inhibition in Human Colon cancer SW480 cells in vitro. Methods Treated with ampelopsin at several concentrations, MTT and flow cytometry was used to detect the inhibition rate and apoptotic rate of SW480 cells. Western-blot was used to investigate expression of Bcl-2 family protein. Results Significant difference of cell growth inhibition rate was observed among all groups after treated with ampelopsin (p<005). Cell growth inhibition rate in the low-dosage group was significantly high than that in median and high-dosage group (p<0.05), while no marked difference was observed between the median and high groups (p>0.05). The similar results were observed in the experiment on apoptosis induction. Level of Bcl-xL was significantly up-regulated. Level of Bax, Bid, Caspase-3, p-Capase-9 and Caspase-9 was significantly down-regulated after treatment of ampelopsin. Conclusion Ampelopsin can inhibit cell growth and induce apoptosis of SW480. Bcl-2 family protein might be involved in the progress.
     【Key words】  Ampelopsin, SW480cells, Inhibitory effect, Apoptosis
     【Author′s address】 Guangzhou Municipal Hospital of Traditiond ChineseMedicine, Guangzhou, PRC, 510130
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.08.005

  蛇葡萄素(Ampelopsin, APS) 是从我国华南一带分布广泛的几种蛇葡萄属(Ampelopsis Michx) 民间药用植物中提取的一种黄酮化合物，我们的前期研究发现其对结肠癌Lovo细胞具有显著的抑制增殖和诱导凋亡的作用，为了进一步证实其对结肠癌治疗的有效性，本实验观察了APS对人结肠癌SW480细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用,并对其诱导凋亡的机制进行了初步探讨。
     1 材料与方法
1.1 主要材料和试剂
     蛇葡萄素: 广州中医药大学中药化学教研室提取、分离, 含量≥95%。RPM I-1640培养基、小牛血清、0.25% trypsin 胰酶、DMSO(二甲基亚枫)和Penstrep 青链双抗均购自 GIBCO 公司。溴化噻唑蓝四唑(MTT)购自Sigma公司。结肠癌SW480细胞株购自中科院上海生命科学院细胞生化所。Tunel凋亡检测试剂盒购自YEASEN公司。
1.2 细胞培养
     将细胞株培养于含10%小牛血清及100 U /ml青霉素100 U /ml链霉素的RPMI-1640培养液中，置培养箱(恒温37 ℃, 5%CO2,饱和湿度)中培养，每24 h更换1次培养液，2～3 d传代1次，取对数生长期的细胞分设空白对照和低、中、高浓度蛇葡萄素处理组进行试验，经处理48 h后收集细胞进行具体检测。
1.3 MTT法检测细胞活性
     采用Carmichael的MTT法［1］。按照4 000 个细胞/孔的密度将细胞接种于96 孔板，每组分设5 复孔。24 h后, 加入含有不同浓度蛇葡萄素的培养液继续培养24 h，然后每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl培养4 h, 吸去培养液,每孔加入DMSO 15 μl，避光孵育10 min，微震荡器震荡15 min，酶标仪上492 nm波长测光密度值。以公式(IR): IR=(OD 对照组- OD药物组) /OD对照组×100%计算对细胞的增殖抑制率。
1.4 流式细胞仪测定细胞凋亡
     洗涤后加入0.1%甲醛并置于冰盒内固定30 min， 继之再次PBS冲洗2次，加入70%冰冷乙醇溶液固定保存备用，检测前以PBS洗涤2次，加入含0.5%小牛血清的PBS重悬细胞（总体积约200 μl），按照Tunnel染色试剂盒说明加入相关抗体后在常温下孵育30 min，PBS洗涤2次后，重悬并调整细胞浓度达106/L后上机检测，使用FlowJo 7.6软件就检测结果进行分析，实验结果重复3次。不同浓度的蛇葡萄素处理细胞48 h后，吸除培养液，PBS冲洗2次，加入胰酶消化并收集细胞，再次以PBS洗涤2次。
1.5 Western-blot检测Bcl-2家族蛋白表达
     药物处理48 h后，收集细胞。加入RIPA裂解，提取蛋白，并采用BCA试剂盒进行蛋白定量。将等量蛋白加入到12%的分离胶中电泳，约1 h后，将胶取出，采用半干法进行转膜。5%的脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗4 ℃过夜。回收一抗溶液，洗膜溶液内反复冲洗，加入二抗孵育1 h，回收二抗液，反复冲洗后，加入ECL显影剂显影。
1.6 统计学处理 
     数据采用(±s)表示, 利用SPSS 16.0 数据统计软件包进行数据处理, 计量资料采用t检验或多因素方差分析, 计数资料采用卡方检验。p<005被认为具有统计学意义。
     2 结果
2.1 蛇葡萄素抑制人大肠癌SW480细胞增殖
     MTT法检测各给药组与对照组细胞活性显示， APS各组细胞的活性显著低于空白对照组（p<005）。APS高、中剂量与低剂量组之间的活性也存在显著性差异（p<005）。而高剂量和中剂量组之间的细胞活性无显著性差异（p>005）（见表1）。

表1 MTT法检测增殖抑制作用

（±s）

组别	剂量/μg·ml-1	光密度	增殖抑制率
阴性对照	-	0.520±0.130	-
APS（低）	20	0.370±0.143	29.421±28.3701)
APS（中）	80	0.025±0.005	94.132±2.5061)2)
APS（高）	160	0.046±0.006	91.216±0.4501)2)3)

注：IC50=17.20 μg/ml，1)与阴性对照组相比，2)与低浓度组相比，3)与中浓度组相比
2.2 蛇葡萄素诱导人大肠癌SW480细胞发生凋亡
     与空白对照组相比，APS各给药组细胞的凋亡率显著增高(p<001), APS高、中、低三个浓度组之间比较显示, 高、中浓度组与低浓度组之间有统计学意义的差异(p<001), 而高浓度和中浓度组之间无统计学意义的差异(p>005)(见表2)。

表2 流式细胞仪方法检测细胞的凋亡率

（±s）

组别	剂量／μg·ml-1	凋亡率／%	备注
阴性对照	-	3.2±0.8
APS（低）	20	11.10±1.81)
APS（中）	80	34.03±2.91)2)	二倍体峰左移
APS（高）	160	37.53±2.11)2)3)	二倍体峰较其他 组别明显左移

注：1)与阴性对照组相比，2)与低浓度组相比，3)与中浓度组相比
2.3 蛇葡萄素能上调Bid及Bax的表达
     经不同浓度的蛇葡萄素处理48 h后，我们检测了各处理组细胞凋亡的标志物Caspase-9、Caspase-3及BCL-2家族的促凋亡分子Bid及Bax表达情况（见图1），在此基础上，我们测量了图中代表蛋白表达水平的各条带灰度值（见表 3），结果显示：凋亡的标志物Caspase-9、Caspase-3及BCL-2家族的促凋亡分子Bid及Bax表达显著增加，而抗凋亡分子Bcl-xl表达无显著改变。另外，上述因子的表达水平随着蛇葡萄素浓度的增加而增加（见图2）。

图1 经不同浓度蛇葡萄素处理后Bcl-2家族蛋白的表达情况

表3 各浓度组不同蛋白的条带灰度值

（±s）

	对照组	低浓度组	中浓度组	高浓度组
Bcl-xL	1	0.750576±0.06	0.627178±0.09	0.593906±0.07
Bax	0.999999	1.950332±0.1	2.645262±0.08	3.813653±0.06
Bid	1	2.158238±0.07	2.000309±0.1	2.952968±0.08
Caspase-3	1	0.798979±0.05	0.814276±0.09	2.412067±0.11
p-Caspase-9	1.000002	1.012927±0.06	1.354561±0.09	2.924283±0.13
Caspase-9	1.000002	0.88822±0.04	1.29634±0.08	1.771061±0.09

图2 各处理组不同蛋白分子表达情况
3 讨论
     蛇葡萄素是由在华南一带分布的几种蛇葡萄属民间药用植物中提取的一种黄酮化合物。研究发现，蛇葡萄素不但具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡的作用，还能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，如：曾飒等［2］研究发现蛇葡萄素不但能够在体外抑制肺癌GLC282细胞株的增殖，诱导其凋亡，还能抑制裸鼠移植瘤的生长。不止肺癌细胞，在黑色素瘤细胞及大肠癌Lovo细胞也有类似的作用［3］。本研究利用结肠癌细胞株SW480进行的增殖及凋亡实验充分证明了蛇葡萄素对肿瘤细胞的抑制增殖，诱导凋亡的作用。同时，本研究还发现，蛇葡萄素抑制增殖、诱导凋亡的作用呈现一定的浓度依赖性，这与其它文献报道是一致的。然而，我们在前期研究中发现［4］，蛇葡萄素对Lovo细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用不会随着剂量的增加不断增强，而是有一定的剂量范围，超过一定剂量后继续增加其浓度或剂量并不能增加它的抗肿瘤效果。这一结果并没有很好地在SW480细胞中体现，造成这种现象出现的原因尚不清楚，但不能排除细胞本身生物学特点因素，要搞清此疑问，尚需要利用更多细胞株进行相关内容的研究。
     Bcl-2家族是当前研究最广泛的一类细胞凋亡调控因子，其中Bcl-xL是已知最强的抗凋亡因子之一，与肿瘤的发生及耐药性关系紧密。而Bax、Bid是主要的促凋亡因子，其二者的过表达可直接促使多种细胞发生凋亡，也可以促进其他因素诱导的多种细胞凋亡。促凋亡因子和抗凋亡因子的共同作用在调控凋亡中发挥重要作用。Caspase家族蛋白被认为是凋亡过程中的执行者，其中最重要的是Caspase-3和Capase-9,其中Caspase-3和9的激活能促使细胞发生凋亡。本研究中对上述Bcl-2家族蛋白的检测结果表明，经不同浓度的蛇葡萄素处理48 h后，出现了显著的Bcl-x下调，Bax、Bid及Caspase-3、p-Capase-9和Caspase-9的表达上调，提示蛇葡萄素凋亡诱导作用可能是通过Bcl-2家族蛋白实现的。目前已有不少关于蛇葡萄素诱导肿瘤细胞发生凋亡的研究报道［5-7］，研究也表明蛇葡萄素能够诱导体外培养的人肝癌细胞凋亡, 其作用具有时间和浓度依赖性, 并且，下调Bcl-2、上调Bax表达、活化caspase-3可能是其诱导Bcl-2 细胞凋亡的机制。从这一方面看，本研究结果同其他文献报道是一致的。然而，我们的结果显示Caspase-3和p-Caspase-9及Caspase-9的仅在中、高浓度组中显著升高，而在低浓度组中并显著升高，不能除外低浓度蛇葡萄素会通过其他途径发挥其凋亡诱导作用。
     综上所述，蛇葡萄素不仅能抑制结肠癌SW480细胞增殖，还能诱导其凋亡，其对凋亡的诱导作用是通过内源性凋亡途径，借助上调Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bid和Bax的表达实现的。然而，此结论仅来自体外实验研究，在体内是否也有类似的效果，需要进一步的深入探讨。

参考文献
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［3］ 刘德育,郑宏强,罗高琴.蛇葡萄素体内外对小鼠B16黑色素瘤侵袭和转移的抑制作用［J］.中国中药杂志,2003,28(10):957-961.
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