133例霍奇金淋巴瘤中EBERs表达与临床分期、疗效相关性分析

基金项目：国家自然科学基金青年项目（编号：81302037），广州医科大学博士启动基金（编号：2012C65）
胡利娟 胡小山 聂 豪 周 旻：广州医科大学附属肿瘤医院 广东广州 510095
钟 茜：中山大学肿瘤防治中心 广东广州 510060
通讯作者：周 旻

133例霍奇金淋巴瘤中EBERs表达与临床分期、疗效相关性分析

胡利娟 钟 茜 胡小山 聂 豪 周 旻
THE CORRELATION BETWEEN EBERS EXPRESSION AND CLINICAL STAGE/CHEMOTHERAPY EFFECT IN 133 CASES OF HODGKIN′S LYMPHOMA
HU Lijuan, ZHONG Qian, HU Xiaoshan, et al

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  【摘 要】 目的 探讨霍奇金淋巴瘤中EBV感染情况，通过EBERs原位杂交，分析其表达与HL临床分期之间的关系；此外，进一步探讨EBV的感染对于HL化疗疗效的影响。方法 收集了133例霍奇金淋巴瘤患者的石蜡标本、以及查阅详细的临床资料，进行EBERs原位杂交染色，统计分析EBERs的表达与临床分期之间的关系；统计EBV阳性与阴性例数，分组分析EBV对化疗总有效率的影响。结果 Pearson相关分析显示，EBERs的表达与临床分期呈正相关；单因素统计显示，EBV阳性组化疗有效率低于EBV阴性组。结论 EBERs的表达率高的HL患者其临床分期较晚，EBV阳性患者化疗有效率欠佳，提示EBERs可作为HL的独立预后因素。
  【关键词】 霍奇金淋巴瘤,EBV,EBERs,疗效

  【Abstract】 Objective To analyze the relationship between EBERs expression and the clinical stage in Hodgkin′s lymphoma, and explore the infection of EBV affecting the therapeutic effect on patients with HL. Methods  The paraffin-embedded sections and clinical data of 133 patients of HL receiving ABVD regimen chemotherapy for 4-6 cycles were collected. The experiment of EBERs in situ hybridization staining was done to analyze the correlation of EBERs expression and clinical stage. The infection of EBV affecting the therapeutic effect on patients with HL was computed. Results  According to Pearson correlation analysis, EBERs expression was positively correlated with clinical stages. According to the results of single factor analysis, patients with EBV (+) had better curative effect than that of EBV (-). Conclusion  Patients with higher expression of EBERs may have late clinical stage, and the patients with EBV (+) have worse chemotherapy effect. EBV may be the independent factors for affecting the curative effects of HL chemotherapy.
     【Key words】  Hodgkin′s lymphoma, EBV, EBERs, Curative effect
     【Author′s address】 Tumor hospital, Guangzhou medical university, Guangzhou, Guangdong, 510095 PRC
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.11.006 

  霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s Lymphoma，HL），是发生于淋巴组织的恶性肿瘤，与非霍奇金淋巴瘤（NHL）统称为恶性淋巴瘤。HL是西方国家中最常见的肿瘤之一，其发病率高达每年3/100 000，以青年人居多，在我国约占所有淋巴瘤的10%。其病理组织学特征表现为正常淋巴组织结构破坏、多种反应性细胞浸润的背景中散在特征性Reed-Sternberg细胞（RS细胞）及其变异型。随着多药物化疗和/或放疗技术的发展和应用，HL的治疗率高达80%~90%［1］。然而，晚期患者预后仍然不理想，存在难治性、治疗后复发，尤其是自体干细胞移植后复发患者的中位生存时间很少超过3年。因此，需要我们继续寻找新的治疗靶点，准确评估其预后。EBV感染与约40%霍奇金淋巴瘤（HL）的发病相关，EBV表达的非编码RNA（EBERs）部分HL中表达，但其功能和机制并不清楚。
     本研究收集了我院2000~2013年期间133例霍奇金淋巴瘤（HL）患者的石蜡组织标本以及详细的临床资料，进行了EBERs原位杂交染色，并根据染色情况针对HL的临床分期和疗效进行了初步分析，并报告如下：
     1 资料与方法
1.1 临床资料
     收集2000年1月~2013年12月之间在中山大学附属肿瘤医院住院，并经病理学及免疫组化检查确诊的霍奇金淋巴瘤133例，男96例，女37例，男∶ 女=26∶ 1；发病年龄3~75岁，中位发病年龄为39.0岁；其中Ⅰ期20例，Ⅱ期52例，Ⅲ期41例，Ⅳ期20例。
1.2 诊断及分期方法
     浅表淋巴结采用活检手术切取，腹腔淋巴结采用粗针穿刺或手术切除活检。病理学诊断包括HE染色、免疫组化检查。分期基本检查包括：头颈部、胸部、腹部CT或全身PET/CT，骨髓细胞学检查。按Ann Arbor 分期系统分期。
1.3 治疗方法及疗效评价
     所有患者用ABVD方案化疗4~6个疗程，即阿霉素（ADM） 20 mg/m2、静脉滴注、第1和第15天，博来霉素（BLM） 10 mg/m2、静脉滴注、第1和第15天，长春碱（VLB） 6 mg/m2 静脉滴注、第1和第15天，达卡巴嗪（DTIC） 375 mg/m2、第1和第15天，28 d为一个周期。疗效评价采用WHO标准，即完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）、疾病进展（PD）或复发、死亡。其中CR+PR为总有效（OR），SD、PD、复发、死亡为无效。
1.4 EBERs原位杂交染色
     使用EBER原位杂交试剂盒（ISH5022，中杉金桥生物技术有限公司），具体步骤参考试剂盒说明书。染色阳性率计算：每例标本中EBERs阳性的肿瘤细胞占所有肿瘤的百分比。
1.5 统计学方法
     分别计算各组患者化疗的有效率（ORR）。采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，统计描述资料分析采用卡方检验或 Fisher 精确检验。P＜005 为差异有统计学意义。
     2 结果
2.1 EBERs表达与HL临床分期的相关性分析
     133例霍奇金淋巴瘤患者的石蜡切片进行EBERs原位杂交染色，结果发现52例为EBERs阳性，阳性率为39%（52/133），从染色结果看，阳性病例中的EBERs的表达率高低不同（见图1），结合患者的临床分期，进行统计分析，发现EBERs的阳性率和临床分期呈正相关性（r=0.3150, P=0000 2），见图2。提示EBERs表达高的患者临床分期较晚。
2.2 EBV感染对HL化疗疗效的影响
     133例HL患者中，EBV阳性的患者52例，化疗有效为24例，总有效率为46.2%（24/52）；EBV阴性患者81例，化疗有效54例，总有效率为66.7%（54/81），后者高于前者，经卡方检验后，差异有统计学意义（2=5.495，P=0.019 1），见图3。

 

图1 不同霍奇金淋巴瘤标本中EBERs表达的阳性率不同

 

图2 霍奇金淋巴瘤中EBERs的表达与临床分期呈正相关

 

图3 EBV阳性组化疗有效率低于阴性组
3 讨论
     　　EBV在EBV阳性的霍奇金淋巴瘤病例中的重要作用逐步得到证实。首先，HRS细胞中很多受体酪氨酸激酶的表达和EBV之间存在反比关系［2］。其次，体外实验证实EBV解救残缺的生发中心B细胞从而避免凋亡［3-5］。西方国家中，约40%的经典型霍奇金淋巴瘤的HRS细胞中含有EBV［6］，在中美和南美洲儿童霍奇金淋巴瘤的EBV感染率高达90%，AIDS患者的HRS细胞中EBV达100%［7］。在EBV（+）HRS细胞中表达三个病毒蛋白（EBNA1、LMP1、LMP2A）和两个非编码RNAs（BARTs和EBERs）。EBNA1几乎表达于所有的EBV感染的细胞中，与EBV基因组的复制和维持病毒颗粒的稳定性有关。EBNA1可以上调CCL20从而吸引调控的T细胞（T Reg）以及下调抑癌基因蛋白酪氨酸磷酸酶-k，从而参与霍奇金淋巴瘤的发病［8-9］。癌基因

(下转第22页)(上接第18页)
LMP1转化的裸鼠可以发生B细胞淋巴瘤。膜蛋白LMP1模拟CD40受体，激活NF-kB信号通路［10］。此外，在HRS细胞中，EBV与TNFAIP3突变之间存在反比关系，提示EBV在促进TNFAIP3突变的机制中发挥重要作用。
     　　由上可见，EBV感染在HL的发病过程中起到重要作用，而EBERs的表达是否在HL的发生发展过程中发挥重要作用、以及对于HL的治疗产生什么影响尚不清楚。我们收集的病例中进行EBERs原位杂交染色，发现不同的病例其阳性率是不同的，因此联合HL的临床分期急性相关性分析，结果发现EBERs的表达和临床分期呈正相关；此外，将EBV感染是否阳性进行分组，分别分析其化疗总有效率，发现和EBV阴性患者相比，EBV阳性的患者化疗总有效率较低，提示EBERs可以作为霍奇金淋巴瘤患者的独立预后因素。但是EBERs在HL的发病过程中具体的功能和分子机制，尚需要进一步研究。

参考文献
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［2］ RENNE C, HINSCH N, WILLENBROCK K, et al. The aberrant coexpression of several receptor tyrosine kinases is largely restricted to EBV-negative cases of classical hodgkin′s lymphoma［J］. Int J Cancer, 2007,120(11):2504-2509.
［3］ BECHTEL D, KURTH J, UNKEL C, et al. Transformation of BCR-deficient germinal-center B cells by EBV supports a major role of the virus in the pathogenesis of hodgkin and posttransplantation lymphomas［J］. Blood, 2005,106(13):4345-4350.
［4］ MANCAO C, ALTMANN M, JUNGNICKEL B, et al. Rescue of "crippled" germinal center B cells from apoptosis by epstein-barr virus［J］. Blood, 2005,106(13):4339-4344.
［5］ CHAGANTI S, BELL AI, PASTOR NB, et al. Epstein-barr virus infection in vitro can rescue germinal center B cells with inactivated immunoglobulin genes［J］. Blood, 2005,106(13):4249-4252.
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［10］ KUPPERS R. The biology of hodgkin′s lymphoma［J］. Nat Rev Cancer, 2009,9(1):15-27.