细胞DNA定量分析技术在宫颈癌及癌前病变早期筛查中的应用价值

基金项目：卫生部科研基金（编号：W2012GJ49）
何小英 唐发清：珠海市人民医院 广东珠海 519000
田卫华：深圳市罗湖区人民医院 广东深圳 518000

细胞DNA定量分析技术在宫颈癌及癌前病变早期筛查中的应用价值

何小英 唐发清 田卫华
THE VALUE OF CELL DNA QUANTITATIVE ANALYSIS IN THE EARLY SCREENING OF CERVICAL CANCER AND PRE-CANCERATION 
HE Xiaoying, TANG Faqing, TIAN Weihua

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  【摘 要】 目的 分析细胞DNA定量分析技术对宫颈癌及癌前病变进行早期筛查的临床意义。方法 选取2012年11月~2014年11月间收治的80例宫颈病变患者作为临床研究对象，均实施宫颈刷取材检测，制作出两张宫颈液基细胞学制片，一张采用硫堇-Feulgen进行染色，然后通过细胞DNA定量分析系统定量检测其细胞核中的DNA含量；一张采用巴氏染色后进行常规细胞学检测。若检测的结果为阳性则进行阴道镜或于阴道镜指导下取检，然后通过活检的结果对两种方法的准确性进行比较分析。结果 通过进行细胞DNA定量分析发现，检测所得宫颈阳性病变70例；而通过进行常规细胞学检验发现，检查所得宫颈阳性病变27例。根据组织学诊断宫颈癌病变的相关标准对两种检测方法进行评价可得，细胞DNA定量分析的相对敏感性（Se）为94.8%，相对特异性（Sp）为99.6%。而常规细胞学检验的相对敏感性（Se）为38.8%，相对特异性（Sp）为99.8%。两种检测技术的相对敏感性比较，差异均有统计学意义(p<0.05)。结论 细胞DNA定量分析技术在宫颈癌及癌前病变的早期筛查中具有非常高的临床价值，值得在临床上进一步推广。
  【关键词】 细胞DNA定量分析技术,宫颈癌,癌前病变,筛查

  【Abstract】 Objective To evaluate the application of DNA image cytometry in screening cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer. Methods 80 patients with cervical intraepithelial neoplasia admitted during November 2012 and November 2014 were involved in this study. The samples from all the patients were taken by cervix brushes and prepared for 2 slides: one for liquid-based cytology staining, read by cytologist, and the other for Thionin-Feulgen staining, tested by DNA image cytometry. The biopsy was performed with direction of colposcopy if one test was positive to verify the sensitivity and specificity of the two methods of staining. Results 70 cases were positive by DNA image cytometry and 27 ones were positive by liquid-based cytology. There was statistically significant difference in the sensitivity between the DNA image cytometry and the liquid-based cytology (948% vs. 388%; p<0.05), but no difference in the specificity between them (99.6% vs. 99.8%). Conclusion Besides its good specificity, DNA image cytometry is more sensitive in screening cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer.
     【Key words】  DNA image cytometry, Cervical cancer, Screening
     【Author′s address】 The People’s Hospital of Zhuhai, Zhuhai 519000, Guangdong Province， China
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.05.034

  宫颈癌是临床上一种非常常见的恶性肿瘤，其在女性恶性肿瘤中的发病率居于第二位，仅次于乳腺癌。调查显示，宫颈癌在我国的发病率和病死率均明显高于其它发达国家，据分析这与我国在适龄妇女的宫颈癌前病变的早期筛查和诊断上的缺乏有关［1］。相关研究表明，对适龄妇女进行定期的连续的宫颈癌前病变筛查对降低宫颈癌的发病率及病死率具有非常重要的临床意义［2］。目前，临床上主要通过检测宫颈的脱落细胞来筛查宫颈癌前病变，该方式在宫颈癌的预防和控制中的效果已获临床肯定，明显降低了宫颈癌的发病率和病死率。近年来，随着科学的不断进步，大量的宫颈癌筛查及诊断方法逐渐出现，其中的宫颈液基细胞学技术、HPV-DNA病毒检测及细胞CAN定量分析技术等方法均在临床上得到了广泛的应用［3-5］。因此，为了分析细胞DNA定量分析技术对宫颈癌及癌前病变进行早期筛查的临床价值，本次研究选取2012年11月~2014年11月间我院收治的80例宫颈病变患者作为临床研究对象，均施行细胞DNA定量分析技术进行检测，取得了良好的效果，现总结如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料
     本次研究选取2012年11月~2014年11月间我院收治的80例宫颈病变患者作为临床研究对象，年龄23~53岁，平均（37.54±4.87）岁。
1.2 仪器与材料
     仪器采用麦克奥迪实业集团有限公司生产的MotiCytometer全自动细胞DNA图像定量分析系统，细胞制片的相关试剂及细胞保存液均由该公司提供。对硫堇-Feulgen试剂进行配置，材料包括：5 mol/L的盐酸4 ml，硫堇200 mg，偏重亚硫酸钠200 mg，蒸馏水196 ml，将上述材料进混合搅拌，待充分溶解后进行过滤，封好瓶口并放于冰箱中备用。对固定液进行配置，材料包括：甲醇320 ml，甲醛60 ml，冰醋酸20 ml，将上述材料混合后放于冰箱中备用。
1.3 方法
1.3.1 宫颈液基细胞学制片 把装有样品的收集管放置于点触式混匀器上，振荡3~5 s，取6 ml振荡后的溶液进行离心，1 500 r/min，离心5 min。除去上清液后加入适量蒸馏水进行稀释，使细胞沉淀。再将收集管放入点触式混匀器上，振荡3~5 s。振荡后取两滴细胞悬液放于小圆底试管中，加入细胞分散剂100 μl，再次进行混匀后通过自然悬滴法进行制片，制片2张，晾干后可得直径约为1 cm的薄层细胞涂片。一张采用硫堇-Feulgen进行染色，然后通过细胞DNA定量分析系统定量检测其细胞核中的DNA含量；一张采用巴氏染色后进行常规细胞学检测。
1.3.2 硫堇-Feulgen染色 将薄层细胞涂片放置于固定液中进行固定50 min，使用自来水进行洗涤4~5次后再使用蒸馏水进行洗涤；于（25±3）℃的温度下置于5 mol/L的盐酸中水解1 h；使用自来水洗涤4~5次后再使用蒸馏水进行洗涤；于（25±3）℃的温度下放入配置好的硫堇-Feulgen试剂中进行染色75 min，使用自来水洗涤4~5次后放入蒸馏水中浸洗15 min；然后依次将涂片放入85%浓度的乙醇，95%浓度的乙醇Ⅰ、Ⅱ，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ进行逐级脱水，均分别浸泡1 min；最后将涂片放于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中进行透明，各2~3 min，采用中性树胶进行封片。
1.3.3 细胞DNA定量分析 采用MotiCytometer全自动细胞DNA图像定量分析系统对所有经过硫堇-Feulgen染色的细胞涂片进行扫描和分析。将扫描系统的摄像头对准细胞涂片的切片标本后开始进行细胞核的扫描检测，以正常的细胞作为对比，并按照参数特征值对测定的细胞进行计数和分类，从而得到细胞核NDA的含量指数。在进行细胞核DNA定量分析后采用TBS诊断报告进行诊断和分析。根据诊断的结果，按照TBS诊断的相关标准［6-7］对细胞涂片中的腺上皮细胞与鳞状上皮细胞进行诊断。其中腺上皮细胞包括非特异性腺细胞、非典型腺细胞、来源未知的腺癌及宫颈腺癌等；鳞状上皮细胞包括未在上皮中发现病变或恶性病变、无法排除高度鳞状上皮中出现病变的不典型的鳞状细胞、没有明确意义的不典型鳞状细胞、高度鳞状上皮内病变及低度鳞状上皮内病变等。
1.4 判定标准
     对活检的检测结果进行阳性和阴性判定，其中阳性是指在检测目标中发现有DNA含量≥5C的倍体异常细胞，且数量≥3个，而增生细胞的含量超过总检测细胞数量的10%。同时还有疑似为阳性的结果，即在检查目标中发现有DNA含量≥5C的倍体异常细胞，数量为1~2个，同时增生细胞的含量为总检测细胞数量的5%~10%；而阴性是指在检查目标中出现许多正常的2倍体细胞，未出现DNA含量≥5C的倍体异常细胞，且增生细胞的含量低于总检测细胞数量的5%。
1.5 统计学方法
     将数据纳入SPSS 19.0统计软件中进行分析，采用2比较对计数资料进行比较，以率（%）表示，采用t检验对计量资料进行比较，并以（±s）表示，若（p＜0.05）则差异显著，有统计学意义。
     2 结果
     通过进行细胞DNA定量分析发现，检测所得宫颈阳性病变70例；而通过进行常规细胞学检验发现，检查所得宫颈阳性病变27例。根据组织学诊断宫颈癌病变的相关标准对两种检测方法进行评价可得，细胞DNA定量分析的相对敏感性（Se）为94.8%，相对特异性（Sp）为99.6%。而常规细胞学检验的相对敏感性（Se）为38.8%，相对特异性（Sp）为99.8%。两种检测技术的相对敏感性比较，p<0.05,差异均有统计学意义。
     3 讨论
     宫颈癌是临床上一种常见的妇科恶性肿瘤，多发于30~35岁的女性，其发病原因主要和生物学因素及病毒感染等原因有关［8］。近年来，宫颈癌的发病率逐年上升且逐渐趋于年轻化，对于广大女性患者的身体健康和生命安全造成了非常严重的影响。因此，加强宫颈癌前病变的早期筛查具有非常重要的临床意义。
     肿瘤细胞在进行生长和增值时，其细胞核中的DNA含量的变化与正常细胞有着明显的区别，所以可以通过测定细胞核中的DNA含量来对恶性增殖的肿瘤细胞进行诊断。相关研究表明，细胞核中DNA含量的变化能够直观地反应细胞的生长和增殖能力。恶性肿瘤细胞的细胞核中的DNA含量会明显增加，故临床上通常通过测定细胞DNA的含量来作为肿瘤细胞的客观定量标准［9］。而细胞DNA定量分析技术主要是通过人工智能技术、细胞图像分析技术及光密度对比分析方法等技术来对细胞核中的DNA含量进行定量分析。大量的临床研究表明，采用细胞DNA定量分析技术能够对恶性肿瘤细胞的预后评估和治疗指导提供科学准确的临床依据［10-11］。
     本次研究结果显示，通过进行细胞DNA定量分析发现，检测所得宫颈阳性病变70例；而通过进行常规细胞学检验发现，检查所得宫颈阳性病变27例。阳性是指患者的细胞有很大几率发生癌变，故我们将其作为检测宫颈癌前病变的标准。由此可以看出，细胞DNA定量分析技术对于宫颈癌前病变的检出率更高。同时，细胞DNA定量分析的相对敏感性（Se）为94.8%，相对特异性（Sp）为99.6%。而常规细胞学检验的相对敏感性（Se）为38.8%，相对特异性（Sp）为99.8%。这表明在两种检测技术的相对特异性都比较高的基础上，细胞DNA定量分析的相对敏感性明显高于常规细胞学检测，p<0.05,差异均有统计学意义。
     综上所述，细胞DNA定量分析技术在宫颈癌及癌前病变的早期筛查中具有非常高的临床价值，值得在临床上进一步推广。

参考文献
［1］ 陈汉明.宫颈癌危险因素调查分析［J］.现代医院,2011,11(1):44-45. 
［2］ 邝红芳,巫雪珍,魏永聪,等.液基薄层细胞学筛查宫颈癌的应用价值［J］.现代医院,2010,10(z1):60-61. 
［3］ 蔡小娟,李梅娟.高危型人乳头瘤病毒检测与液基细胞学检查在宫颈癌筛查中的联合应用价值［J］.现代医院,2010,10(z2):81-82. 
［4］ 李震乾,林爱珍,崔金环,等.HPV-DNA检测与TCT检查在宫颈癌前病变筛查中的相关性［J］.现代医院,2010,10(1):28-30. 
［5］ 闵 玲,钟亮星,陈琳娜,等.血清TSGF、SCC联合检测在宫颈癌诊断中的应用价值［J］.实用医学杂志,2014,30(6):898-900.
［6］ 余秀荣,刘 勇,王 旭,等.细胞DNA倍体定量分析技术在宫颈癌普查中的应用价值［J］.诊断病理学杂志,2011,18(4):289-292.
［7］ 黄晋琰,梁凯雯.宫颈不典型鳞状细胞HPV-DNA检测及阴道镜检查120例分析［J］.现代医院,2010,10(4):24-25. 
［8］ 杨玉涛,张 帆,曾 莉,等.细胞DNA定量分析技术在宫颈癌筛查中的回顾性研究［J］.中国妇幼保健,2013,28(14):2304-2306. 
［9］ 刘国成,赵莉娜.PDGF-A,B在宫颈鳞癌中的表达及临床意义［J］.现代医院,2012,12(11):19-21.
［10］ 李峥嵘,李沛隆.宫颈癌发病情况及细胞 DNA 定量分析技术应用于宫颈癌筛查的临床研究［J］.临床医学,2014,33(6):94-96.
［11］ 莫伟杰,吴月莲.细胞DNA定量分析技术在宫颈癌筛查中的应用［J］.中国临床新医学,2012,5(3):270-273.