泌尿系肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞表达及临床意义的研究

基金项目：国家自然科学基金（编号：81272810）
王延军 陆 伟 郭胜杰 李永红 周芳坚：中山大学附属肿瘤医院 广东广州 510000
陆 伟 张 蒙 蔡志明：安徽医科大学深圳二院临床学院 广东深圳 518000
通讯作者：周芳坚

泌尿系肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞表达及临床意义的研究

王延军 陆 伟 郭胜杰 李永红 张 蒙 蔡志明 周芳坚
EXPRESSION AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF CIRCULATING TUMOR CELLS IN PATIENTS WITH URINARY SYSTEM TUMOR
WANG Yanjun, LU Wei, GUO Shengjie, et al

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  【摘 要】 目的 检测泌尿系肿瘤患者外周血中循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells,CTCs）及其临床意义。方法 选取2014年6月~2015年2月在中山大学附属肿瘤医院泌尿外科就诊的泌尿系肿瘤患者24例，其中睾丸肿瘤6例，肾透明细胞癌4例，前列腺癌8例，膀胱癌6例，分别采外周静脉血5~8 mL，利用微流体技术进行外周血CTCs检测。结果 在2例睾丸肿瘤外周血中检测到8个CTCs，3例前列腺癌外周血中检测到11个CTCs，2例膀胱癌外周血中检测到5个CTC，1例肾透明细胞癌外周血中检测到1个CTC。结论 CTCs在未来可能作为泌尿系肿瘤早期诊断、术后随访及预后预测的无创标志物。
  【关键词】 睾丸肿瘤； 泌尿系肿瘤； 前列腺癌； 循环肿瘤细胞； 微流体技术

  【Abstract】 Objective Discuss the expression and clinical significance of circulating tumor cells(CTCs) in peripheral blood of patients with urinary system tumor. Methods Drawing peripheral blood 5~8ml respective from 24 patients with urinary system tumor who treated in the department of Urology in Sun Yat-Sen University Cancer Center from June 2014 to February 2015.Using microfluidic technology to detect the CTCs in peripheral blood. Results 8 CTCs were detected in peripheral blood of 2 patients with testicular tumor.11 CTCs were detected in peripheral blood of 3 patients with prostate cancer.5 CTCs was detected in peripheral blood of 1 patient with bladder cancer.1 CTC was detected in peripheral blood of 1 patient with clear cell renal cell cancer(ccRCC).Conclusions CTCs may used as a noninvasive marker in early diagnosis，postoperative surveillance and prognostic prediction of patients with urinary system tumor in future.
     【Key words】  Testicular tumor,Urinary system tumor,Prostate cancer ,Circulating tumor cell,Microfluidic technology
     【Author′s address】 Sun Yat-sen university cancer center, Guangzhou, Guangdong, 510000 PRC
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.11.008 

  泌尿系肿瘤的发病率和死亡率在我国有不断增长趋势。其中，前列腺癌发病率最高，达992/10万，膀胱癌约661/10万，肾细胞癌约45/10万，睾丸癌约1/10万。随着肿瘤发病率的提高，早期诊断和治疗在提高患者生存率及延长生存时间中发挥重要作用。目前，对于除前列腺癌和睾丸癌之外的泌尿系肿瘤尚无有效的无创术前诊断标志物，大多数患者在就诊时肿瘤已处于进展期，失去了最佳治疗时机。前列腺癌中应用最广泛的前列腺特异抗原（PSA）在实际临床应用中仍有一定局限性。目前应用于睾丸癌诊断和随访检测的血清肿瘤标志物AFP、βHCG、LDH对于睾丸生殖细胞肿瘤有80%的有效率，但对于单一的畸胎瘤成分却不升高。泌尿系肿瘤患者术后随访发现转移灶的金标准为影像学检查，但仍无法发现微小转移灶。因此，亟需一个新的肿瘤标志物用于泌尿系肿瘤的早期诊断、预后预测和随访检测，CTCs应运而生。 
     1 对象与方法
1.1 研究对象
     病例选自2014年6月~2015年2月在中山大学附属肿瘤医院就诊的泌尿系肿瘤患者24例，所有患者病理类型均经病理科医师最后确诊。其中8例前列腺癌患者均为去势抵抗型前列腺腺癌，膀胱癌均为尿路上皮癌，TNM分期均为T1N0MO，4例肾透明细胞癌分期均为T1N0M0，睾丸肿瘤详细临床资料（见表1）。受试人员的主要纳入标准有：受试者既往无其他肿瘤病史；有明确的原发病灶或已经病理确诊为恶性肿瘤；原发肿瘤病灶已切除但有明确转移病灶，术前采血且采血时间距最后接受化疗时间大于2周。所有患者及其家属自愿签署知情同意书。

表1 睾丸肿瘤基本临床信息及检测结果

 

编号	病理类型	TNM分期	AFP/(ng·mL-1)	βHCG/(IU·-1)	LDH	CTCs
1	精原细胞瘤	T1N0M0	2.7	0.194	168.7	0
2	胚胎性癌+绒毛膜癌	T1N0M0	1491.27	4672.83	138.9	0
3	恶性性索间质细胞肿瘤	T2N3M0	0.973	＜0．1	120.8	2
4	间质细胞瘤	-	1.32	0.1	154.4	6
5	精原细胞瘤	T1N0M0	8.5	14.91	572	0
6	胚胎性癌	T2N3M0	2.52	0.1	181.4	0

1.2 实验原理
     　　由于CTCs和正常细胞（包括白细胞）在尺寸大小和变形特性有所差异，即CTCs大于其他细胞；在微流弯道内，所受由离心力形成的迪恩二次流（Dean Drag Force）和剪切力（Lift Force）不同；其中剪切力与拉力之间的比值与细胞体积大小呈三次方关系，当细胞在微流通道内趋于平衡位置时，尺寸较大的细胞如CTCs趋于流向通道内侧，而白细胞等正常细胞则趋于流向通道外侧；在微流通道的出口处的设置两个出口以此实现CTCs的富集分离。
1.3 实验试剂
1.3.1 红细胞裂解液 10×红细胞裂解液：NH4Cl 829 g，KHCO3 10 g，EDTA 037 g加dH2O 至1 000 mL（高压灭菌,4 ℃保存）
1.3.2 PBS Na2HPO4·2H2O 81 mmol/L, KH2PO4 146 mmol/L, NaCl 138 mmol/L; KCl 27 mmol/L。将粉末充分溶解在800 mL的ddH2O中,调整 pH至74（ 25 ℃），最后定容到1 000 mL, 022 μm过滤，高温灭菌，室温保存。 
1.3.3 固定剂 PFA原溶液浓度为20%，使用前用PBS新鲜稀释成1%的PFA浓度使用。 
1.3.4 透膜剂 100%胎牛血清（Gibco）和10% Triton X-100，使用前用PBS配制成终浓度为2%胎牛血清和 01%Triton X-100的新鲜工作液，一天内用完。 
1.4 实验器材
     倒置荧光显微镜（Olympus）、低温离心机（水平转子）、台式离心机（Eppdorf）、实验室单推注射泵（兰格精密泵）、超净台（苏州安泰）、旋转混合仪（金坛华城海龙）。
1.5 实验方法
1.5.1 患者样品的收集和运输 采集5~8 mL的泌尿系肿瘤患者外周血，血液收集在EDTA抗凝管中，轻柔上下颠置混匀。新鲜血样0~4 ℃保存和运输，在运输过程中避免震荡和碰撞。 
1.5.2 患者样品循环肿瘤细胞的分离和染色样本前处理（红细胞裂解） 将5~8 mL全血转移至一支50 mL离心管中，加入40 mL红细胞裂解液，轻柔地上下颠倒5次；在室温孵育约5 min，可适当孵育更长时间，直至出现透明红；离心4 ℃,300 x g，10 min,离心后可见管底有略带红色细胞团块，弃上清；加入4 mL PBS，重悬细胞，注意轻柔上下吸取使细胞团块分散。
1.5.3 循环肿瘤细胞分离 微流体芯片结构由6圈螺旋微通道、两个入口、两个出口构成。螺旋通道直径600 μm，半径为8~24 mm；用注射泵向微流体螺旋芯片中以2 mL/min速率加入PBS缓冲液、EDTA及牛血清白蛋白。实验开始后，将处理好的血液样本转移至注射泵，注射泵连接微流体芯片入口，以1700 μL/min的速率向芯片中加样；将收集的目的细胞管中的细胞进行涂片。
1.5.4 CTC的免疫染色鉴定 在涂片上铺满固定剂，处理15 min，随后除去固定剂；加入透膜剂，处理15 min；加入一抗混合液（CK，CD45），4 ℃避光过夜孵育；次日用PBS泡洗，7~8 mLPBS在15 min里分三次；加入二抗混合液（Alexa488和Alexa 555），室温避光孵育，在二抗孵育40 min后，加入染核试剂（DAPI），在孵育20 min；用PBS泡洗，7~8 mL PBS在15 min里分三次。
1.5.5 芯片镜检和计数 利用显微镜对芯片进行观察，把CK+（Alexa488）/CD45-（Alexa 555）/nuclear+(hochest 33342)的细胞判断为循环肿瘤细胞。
     2 结果
     　　在2例睾丸肿瘤患者外周血中检测到8个CTCs,3例前列腺腺癌患者外周血中检测到11个CTCs，2例膀胱癌中检测到5个CTCs，一例肾细胞癌中检测到1个CTC（见图1）。

图1 a：抗CD45抗体标记白细胞（呈红色荧光，CD45-555荧光基团）；b：抗CK抗体标记上皮来源细胞（呈绿色荧光，CK-488荧光基团）；c：Hochest 33342染细胞核（呈蓝色荧光）；d：综合a、b、c染色结果，其中CK+（Alexa488）/CD45-（Alexa 555）/Nuclear+(Hochest 33342)的细胞为循环肿瘤细胞（放大倍数为×200）
3 讨论
     CTCs早在1869年就已被shworth发现并提出。它由肿瘤原发灶或转移灶释放入血，是肿瘤发生血行转移的重要条件。如果在肿瘤患者的外周血中检测到CTCs的存在，那就证实有发生远处转移的风险或已发生远处转移，提示预后不良［1］。CTCs受限于实验技术和外周血中CTCs的数量，之前未被重视并广泛开展。但随着医疗技术的发展，CTCs的临床意义已在一些肿瘤特别是乳腺癌中得到证实［2］。它作为一个无创的肿瘤诊断标志物，早期发现肿瘤转移灶及判断患者预后越来越得到广大临床医生和科研工作者的关注。
     在泌尿系肿瘤中，关于CTCs的研究也在不断开展。Johann S等［3］开展的一项针对276例CRPC患者的研究证实CTCs相比于PSA能够更好地预测患者的生存时间，这项研究直接促使FDA批准CellSearch System（CSS）用于前列腺癌患者外周血中CTC的检测。Naoe等［4］首次利用CSS在转移性膀胱癌患者中检测到CTCs。随后的一系列小规模研究发现，在转移性膀胱癌患者中CTCs检出率近50%，且CTCs数量与患者预后、肿瘤分级和转移灶数目关系密切［5-6］。而在肾细胞癌中，CTCs检出率差强人意。Gradilone等［7］对在25例转移性肾透明细胞癌患者中用CSS进行CTCs检测，检出率仅有16%。
     目前，影响CTCs检出率的因素主要有：早期癌症患者外周血中的CTCs数量较少；缺乏有效、可靠的标志物把CTCs从血细胞中分选出来［8］。而新兴的微流体装置利用CTCs与血细胞物理特性的不同，将CTCs从血细胞中分选出并富集。微流体技术相比于传统的磁性细胞分选、密度梯度离心法、免疫细胞化学技术、RT-PCR技术、CellSearch System（CSS）等具有更高的效率，更加便利、实用［9-11］。
     本研究纳入的24例泌尿系肿瘤患者，CTCs综合检出率达1/3，前列腺癌和睾丸肿瘤的检出阳性率较高，肾细胞癌和膀胱癌检出率差强人意。前列腺癌患者均为经手术或药物去势后发展为CRPC，前列腺癌和睾丸癌相比于早期肾细胞癌和膀胱癌更易发生远处转移，侵袭性更高，而本实验纳入的肾细胞癌和膀胱癌临床分期均为Ⅰ期，这可能是不同癌种CTCs检出率差异的重要原因。
     通过检索相关数据库发现，国内尚无有关睾丸癌CTCs的研究报道，原因可能是国内睾丸癌发病率低于欧美国家，睾丸癌的CTCs检测结果不是特别令人满意。国外也仅有Klaus等［12］进行过相关研究。Klaus等抽取143例睾丸生殖细胞肿瘤患者的外周血、19例睾丸肿瘤静脉血和122例正常人血标本作为对照，分别进行CTCs检测，最终在143例睾丸生殖细胞肿瘤患者外周血中有25例检测到CTCs（175%），19例睾丸肿瘤外周血中有12例检测到CTCs（632%），且睾丸肿瘤静脉血中CTCs的数量多于外周血。这直接证明CTCs是由睾丸原发肿瘤病灶直接释放并进入血液，释放入血的CTCs经过内脏器官的过滤后数量减少，这也间接验证了该实验研究目的。研究还发现，在非精原细胞瘤尤其是卵黄囊瘤和畸胎瘤中更易检测到CTCs的存在。卵黄囊瘤不产生AFP、βHCG、LDH等常规的血清肿瘤标志物，而卵黄囊瘤和畸胎瘤恰恰是最容易发生复发和转移的病理类型。因此，CTCs的应用可能在发现卵黄囊瘤患者早期复发和转移中发挥巨大作用。睾丸生殖细胞肿瘤诊断初期，AFP、βHCG、LDH升高的概率也仅有10%~60% (NSGCT), 10%~ 40%,40%~60%［13］。如果非精原细胞瘤切除后血清肿瘤标志物仍升高，则预示预后不良，而这项研究证实CTCs与血清肿瘤标志物水平息息相关。
     纳入实验的6例睾丸肿瘤患者，最终在2例患者外周血中共检测到8个CTCs，CTC阳性率达333%。有趣的是，笔者在1例睾丸间质细胞瘤患者外周血中找到6个CTCs。间质细胞瘤是来源于睾丸间质细胞的一种罕见肿瘤，多为良性，约10%的间质细胞瘤有恶性潜能。在三个大样本长期随访病例中发现，83例间质细胞瘤中18例(217%) 出现肿瘤转移［14-15］。
     CTCs与癌细胞的转移和肿瘤进展相关，在肿瘤的早期诊断及随访监测中将有巨大前景，在泌尿系肿瘤的研究中也取得了一定进展，这将为临床工作带来巨大改变。寻找新的检测方法和标志物来提高检出率将是我们需要攻克的难题。

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